Analys av rotgallnematod i jord med ny DNA-metod

The root-knot nematode, Meloidogyne hapla, is an increasing problem in carrot cultivation in Sweden and Europe. Soil analysis is extremely important to plan sustainable crop rotations, reduce nematode multiplication in soil and eventually minimize yield loss. Traditional soil analyses are time consuming and have low capacity. The overall goal of this project is to provide growers with a cheap and reliable DNA method based on the Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP). The aim is to validate the practical application of LAMP for soil analysis. DNA will be extracted from two soil types to which certain number of second-stage juveniles are added. Two DNA extraction methods will be compared, a simple manual method and a commercial DNA kit. DNA will be extracted from soil samples, collected from field trials in 2017, as well as new samples from commercial fields in Skåne and Gotland. Samples will be analyzed by Seinhorsts elutriation method and by real-time LAMP.

Skador av rotgallnematoder i frilandsgrönsaker, framförallt i morötter, ökar. Jordanalys är en viktig åtgärd för att öka kvaliteten och motverka skördeförlusten. Att ge odlarna tillgång till en snabb och säker metod för att identifiera och kvantifiera rotgallnematoder har därför hög prioritet. Traditionella metoder är tidskrävande och har låg kapacitet. Det övergripande målet är att ge näringen, odlare och rådgivningsbranschen tillgång till en snabb och säker DNA analysmetod baserad Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP). Syftet är att utvärdera praktiskt tillämpning av LAMP för analys av rotgallnematoder i jord. DNA extraheras från två jordtyper, till vilka ett bestämt antal juveniler tillsätts. Två metoder för DNA extrahering jämförs, en enkel metod och ett kommersiellt DNA kit. DNA extraheras från 24 jordprover samlades från fältförsök i 2017 samt från nya prover samlas från kommersiella fält, sedan analyseras med Seinhorsts elutriator metod och valideras med realtids-LAMP.

Jordanalys är viktigt verktyg för planering av hållbara bekämpningsåtgärder mot växtparasitära nematoder. Praktisk tillämpning av en tidigare utvecklad LAMP-metod utvärderades för analys av rotgallnematoden Meloidogyne hapla i jordprover från mototsodlare. DNA extraherades från två jordtyper (lera och sand), till vilka 4–64 juveniler tillsattes per 250 g, samt från 50 fältprover insamlade från olika fält under 2019 och 2020. Två DNA-extraktionsmetoder jämfördes, en procedur med skummjölk (SKMM) och ett kommersiellt kit. Högre koncentration och renare DNA från jordsubstanser erhölls med SKMM. DNA detekterades i enstaka artificiellt smittade prover och i fältprover insamlade i 2019. Nematodpopulationerna minskade kraftigt under vintern och positiv förekomst bekräftades endast i prover från 2 av 6 fält följande vår (33 %). Inom fälts-variation av förekomsten av M. hapla bekräftades med realtid-LAMP. Metoden kostar relativt mindre än andra DNA-metoder och kan kommersialiseras i framtiden.

Problemen med rotgallnematoder ökar i områden med lätta jordar där grönsaker odlas ofta på friland, framförallt i Skåne och på Gotland. Speciellt omfattande skador med stora skördeförluster som följd ser vi i morötter, eftersom deformerade morötter blir osäljbara. Därför vill morotsodlarna helst odla på ”nematodfria” fält. Det är viktigt att veta vilken typ av nematod som finns i jorden för att välja fält och för att planera växtföljd och andra insatser. I Sverige är Meloidogyne hapla den vanligast förekommande arten av rotgallnematoder, och kan orsaka ekonomiska skördeförluster särskilt i morötter. I områden med problem rekommenderas jordprovtagning och analys av nematodförekomst i fältet där morötter ska odlas.
De allra flesta jordprover från kommersiella morotsfält analyseras idag med en tidskrävande metod. Nematoderna ska först drivas ut ur jorden för att sedan räknas och identifieras i vattenlösning. Dessutom räknas endast det rörliga nematodstadiet, de sk juvenilerna, i ett jordprov. Andra stadier som ägg kan också innehålla juveniler, men de räknas inte. Konsekvensen är att rotgallnematodspopulationen i marken kan underskattas. Diagnostiska metoder baserade på molekylär teknik har ökat våra möjligheter att med precision identifiera och kvantifiera växtparasitära nematoder. Den vanligaste molekylära detektionsmetoden är PCR (Polymerase Chain Reaction) och framför allt kvantifiering av nematoder med realtids- PCR. En sådan metod är kommersiellt tillgänglig för analys av rotgallnematoden M. hapla, men används endast för artbestämning. De senaste åren har andra molekylära metoder som Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) utvecklats för säker detektion av en rad patogena svampar, bakterier och växtparasitära nematoder. Vi har tidigare utvecklat en LAMP-analys för att bestämma M. hapla i jord och nu har vi tagit arbetet vidare för att utvärdera och tillämpa metoden i praktiken.
I analyser med molekylära metoder, utvinns först DNA från alla utvecklings- och vilostadier hos nematoderna som finns i jordprovet. Med syfte att minska analystid och kostnad för odlarna, utvecklades en ny DNA- extraktionsteknik s.k. ”SKMM”, baserad på skummjölk i buffert, som jämfördes med ett kommersiellt DNA- extraktionskit (kit 1) följt av två extra kit för DNA rengöring (kit 2 och kit 3). SKMM proceduren var effektiv och billigare än det kommersiella kitet.
Vi har använt en realtids-LAMP (rt-LAMP) för att bekräfta förekomst och bestämma mängden av M. hapla i jord från b la sex kommersiella morotsfält i Skåne. Fälturvalet baserades på provtagning, morfologisk bestämning och kvantifiering under hösten/vinter år 2019–2020. Ett samlingsprov togs i ett ”W” därtill fyra enskilda jordprover från varje fält på våren 2020. Jordproverna analyserades med både rt-LAMP och rt-PCR. Trots hög på hösten, kunde inte rotgallnematoden hittas i nya insamlade prover analyserade med rt-LAMP våren 2020, och inte heller med den andra DNA-baserad tekniken, rt-PCR.
Rotgallnematoden kan överleva det kalla klimatet i Sverige och äggmassorna har stor betydelse för övervintringen. Den kraftiga minskningen av populationerna i våra undersökta fält beror troligen på att det skett en naturlig sanering under vintern, varför det kan vara bättre att provtagning sker tidigt på våren i stället för hösten. Fortsatta undersökningar med provtagning vid flera tidpunkter behövs för att identifiera den optimala tidpunkten för jordprovtagning. Att vi hittade nematoder i två fält kan delvis kopplas till att förfrukten, potatis, lämnar överliggare.
Våra resultat visar också en inomfälts-variation i förekomsten, särskilt i det fältet som hade den högsta nematodtätheten. Analys av de fyra enskilda proverna visade de områden i fältet med hög förekomst ”hot spots”, vilket kunde inte visas med samlingsprovet. Den utvecklade realtids-LAMP metoden är säker, effektiv och är betydligt billigare än andra DNA-metoder och kan kommersialiseras.