Är PCR-analys av heljuverprov en effektiv metod för bakteriologisk undersökning?

Sammanfattning av slutrapport
PCR-analys av mjölkprover är en ny snabb metod att hitta kor med bakterier i mjölk och som har potential att kunna användas vid rutinanalys av provmjölkningsprover. Emellertid är resultaten från PCR-analysen svårtolkade och tekniken behöver den utvärderas mer. I denna studie har vi undersökt hur väl resultaten från PCR-analys av mjölkprover från heljuver överrensstämmer med resultaten av konventionell bakteriologisk odling av mjölkprover från juverfjärdedelar, samt om olika juverhälsomått kan vara till hjälp i tolkningen av resultaten från PCR-analysen. Resultaten visar att överensstämmelsen mellan metoderna är låg, att fler bakterier påvisas med PCR-analys än vid odling men att många av dessa fynd verkar bero på förorening vid provtagningen. Alla undersökta juverhälsomarkörer (celltal, LDH, NAGase, AF) hade signifikanta samband med vissa bakteriefynd vid PCR-analysen, men fler studier behövs för att identifiera gränsvärden som kan underlätta tolkningen av resultaten från PCR-analysen.

Populärvetenskaplig sammanfattning
PCR-analys av mjölkprover är en ny snabb metod att hitta kor med bakterier i mjölk och som har potential att kunna användas vid rutinanalys av provmjölkningsprover eller i on-line system. Emellertid är resultaten från PCR-analysen svårtolkade och innan tekniken används rutinmässigt behöver den utvärderas mer. I en av Stiftelsen Lantbruksforskning finansierad studie har vi undersökt hur väl resultaten från PCR-analys av mjölkprover från heljuver överrensstämmer med resultaten av konventionell bakteriologisk odling av mjölkprover från juverfjärdedelar. Resultaten visar att överensstämmelsen mellan metoderna är låg, att fler bakterier påvisas med PCR-analys än vid odling men att många av dessa fynd verkar bero på förorening vid provtagningen.
Kor med subklinisk (för ögat ej synlig) mastit (juverinflammation) utgör ett dolt hot för andra kor i besättningen eftersom de oftast orsakas av bakterieinfektioner som kan spridas mellan kor. Sådana kor behöver därför identifieras så de kan separeras från friska kor. En celltalshöjning i mjölken tyder på att kon kan ha subklinisk mastit orsakad av bakterieinfektion, men för att bekräfta eller dementera detta brukar man ta mjölkprover från misstänkt/a juverdel/ar för bakteriologisk undersökning. Sådana mjölkprov undersöks idag framförallt med konventionell odlingsteknik (KO) där man får svar tidigast inom 1-2 dygn, men på senare år har en ny snabbare metod utvecklats där man med hjälp av PCR (Polymerase Chain Reaction) teknik kan identifiera DNA från de vanligast förekommande mastitbakterierna i mjölk. En svårighet med PCR-analysen är dock tolkningen av resultaten. Eftersom alla fynd av bakterier som diagnostiken kan påvisa rapporteras kan det vara svårt att avgöra om fynden är ett resultat av förorening eller sann juverinfektion. Vid KO tolkas växt av flera olika bakteriearter på odlingsplattan som blandflora (dvs. förorening), men vid PCR-analys går det idag inte att avgöra om provet är förorenat eller inte. PCR-tekniken är dock fördelaktig om man vill effektivisera provtagningen av kor då den skulle kunna tillämpas på mjölkprover tagna rutinmässigt i samband med provmjölkning, men detta kan öka risken för att provet blir kontaminerat med t.ex. omgivningsbakterier. Dessutom finns risk att mjölkrester från en tidigare mjölkad ko kontaminerar mjölkprovet för efterföljande ko vilket kan ge en missvisande bild av juverinfektionsstatus. En hjälp i tolkningen av svaren kan vara att använda sig av olika juverhälsomått t.ex. celltal, N-acetyl-ß-D-glukosaminidas (NAGase), alkaliskt fosfatas (AF) och laktatdehydrogenas (LDH) då dessa markörer stiger (eller sjunker gällande AF) vid en juverinfektion. Exempelvis skulle då ett högre celltal i prover som är bakteriologiskt positiva tyda på att fynden är från en pågående infektion i juvret, medan om celltalet är lågt kan man misstänka att fyndet är resultatet av en förorening och inte en pågående infektion. Efterfrågan av PCR-analys av mjölkprover är stor i Sverige men då tekniken är ny inom mastitområdet är den inte helt utvärderad än och framförallt tolkning av resultaten från PCR-analysen behöver utredas vilket var syftet med detta projekt.
Mjölkprover (995 st) togs från 976 kor i 25 besättningar. Fjärdedelsmjölkprover, tagna med steril provtagningsteknik, från dagen innan provmjölkningen, från provmjölkningsdagen samt dagen efter provmjölkningen analyserades på SVA med avseende på bakterieförekomst enligt vanlig rutin för KO. Heljuverprov som togs ut samtidigt som provmjölkningsprovet analyserades också på SVA med hjälp av PCR-analys (PathoProofTM Mastitis Complete 12-kit, Thermo Fisher Scientific Inc.). Celltalet analyserades som vanligt i samband med provmjölkning, medan LDH, NAGase och AF analyserades vid Aarhus universitet, Danmark. Flera olika statistiska beräkningar gjordes för att få en uppfattning om överrensstämmelsen mellan de två metoderna och för att se om celltal, LDH, NAGase eller AF kunde användas som hjälpmedel i tolkningen av bakteriefynd gjorda med PCR-analysen.
Resultaten visar att överrensstämmelsen mellan KO och PCR-analys generellt var låg. PCR-analysen påvisade många fler fynd av bakterier per ko och per prov än vad KO gjorde. Emellertid visade PCR-analysen lika ofta positiva fynd hos kor utan tecken på mastit (celltal <100 000 celler/ml mjölk) som hos kor med misstänkt subklinisk mastit (celltal = 100 000 celler/ml mjölk) när bakteriearterna Enterococcus sp., E. coli, Klebsiella sp. och KNS påvisades. Detta tolkar vi som att fynd av dessa bakterier ofta beror på förorening och att man bör ta nya prover från kor med hjälp av steril provtagningsteknik och använda KO för att få ett säkrare resultat. Samtidigt som KO missar en del bakteriepositiva prover tyder våra resultat på att de bakteriefynd som görs med KO oftast görs från kor med misstänkt subklinisk mastit. Prover som var PCR-positiva för bakteriearterna Str. agalactiae, S. aureus, Str. dysgalactiae och Str. uberis kom till största delen från kor med misstänkt smittsam subklinisk mastit, men endast ett fåtal av dessa fynd påvisades som enskilt fynd och provtagning på juverfjärdedelsnivå och analys med KO rekommenderas för att säkerställa diagnosen.
Att färre bakterier påvisades med KO kan delvis bero på att de proverna togs med steril provtagningsteknik vilket innebär att det är mindre risk för att proverna förorenas av bakterier från närmiljön. Heljuverprovet togs däremot inte enligt steril provtagningsteknik och mjölkrester från tidigare kor kan ha funnits kvar i den provmjölkningsutrustning som användes vilket innebär en risk för överföring av bakterier och ett felaktigt analyssvar för aktuell ko. Många av de bakterier som påvisas finns naturligt på huden och i kons närmiljö och det finns ingen möjlighet att avgöra om bakterierna kommer från omgivningen, huden eller juvret. Tas mjölkproverna enligt steril provtagningsteknik är sannolikheten att de flesta påvisade bakterierna kommer från juvret. Sådan provtagning är dock inte alltid praktiskt genomförbar vid provmjölkning, men förmjölkning och rengöring av spenarna enligt rutiner för steril provtagning innan provmjölkningen kan minska risken för falskt positiva kor om man ändå vill använda sådana heljuverprover.
Alla de undersökta juverhälsomåtten (celltal, LDH, NAGase eller AF) hade signifikant samband med ett eller flera bakteriefynd viket tyder på att de skulle kunna användas som hjälp för att tolka resultaten från PCR-analysen. Gränsvärden för celltal (eller LDH, NAGase eller AF) som kan avgöra om en ko troligen har smittsam subklinisk mastit, dvs. där det bakteriella fyndet är av stort intresse för lantbrukaren och veterinären, måste dock undersökas vidare i andra studier.
Slutsatserna av detta projekt är att fler bakteriefynd påvisas med PCR jämfört med KO, men att många av PCR-fynden verkar vara orsakade av förorening då många fynd gjordes i mjölkprov från kor utan tecken på juverinflammation. Alla undersökta juverhälsomarkörer (celltal, LDH, NAGase, AF) hade signifikanta samband med en eller flera av bakteriefynden vid PCR-analysen, men fler studier behövs för att identifiera gränsvärden som kan underlätta tolkningen av resultaten från PCR-analysen.