Biologisk bekämpning - genetisk analys av mekanismer

Sammanfattning av slutrapport
Biologisk bekämpning av växtsjukdomar med jordbakterier har visat sig vara ett miljövänligt och praktiskt tillämpbart alternativ. Bakterier av släktet Pseudomonas använder sig av åtskilliga mekanismer bl. a. produktionen av en svamphämmande metabolit, s. k. DDR. Bakteriemutanter som inte bildar DDR har nedsatt bekämpningsförmåga mot kornets bladfläcksjuka. Ca 40 000 baser av generna som kodar för enzymerna i biosyntesen av DDR har sekvensbestämts. I samarbete med kemister har vi bestämt delar av biosyntesvägen för DDR. Regleringen av den biologiska bekämpningen går via sensorproteiner som sitter i bakteriernas cellmembran och känner av omvärldssignaler. De bestämmer när bekämpning sätts igång. Generna som kodar för två skilda sensorsystem har karakteriserats. I framtiden kommer forskningen att inrikta sig på att identifiera signalsubstanser som sensorerna känner av. Dessa resultat kan leda till användningen av specifika tillsatser vid framställning av mikrobiella bekämpningspreparat.

Populärvetenskaplig sammanfattning
Titel: Biologisk bekämpning - genetisk analys av mekanismer

Syfte: I detta projekt var målet att studera verkan av en speciell bakteriemetabolit och andra faktorer i bekämpningseffektiviteten hos jordbakterier som i tester visat goda effekter mot svampsjukdomar på odlade växter.

Resultat: Det mest uppseendeväckande är upptäckten av sk. globala regleringssystem hos dessa bakterier, som styr såväl metabolitproduktion som andra faktorer som har betydelse för deras bekämpningsaktivitet. Om arbetet hade kunnat fortsätta skulle dessa rön ha gett direkta positiva spin-offeffekter till svenska odlare, eftersom vi skulle ha identifierat faktorer som kan användas som tillsatser (vid sådd eller betning), som kan främja den biologiska bekämpningsaktiviteten hos denna viktiga grupp av antagonistiska bakterier.

Metod: Det genetiska analysarbetet var uppdelat i två delar: 1) metaboliten, sk. DDR, och 2) övriga mekanismer. Del 1) det har varit oklart om, och i så fall på vilket sätt, metaboliten har betydelse för de aktuella bakteriernas bekämpningseffekt. Genom projektet ville vi skaffa bättre kunskaper om detta och har därför studerat DDR (kemisk beteckning: 2,3-deepoxy-2,3-didehydro-rhizoxin) på djupet genom att använda molekylärbiologiska metoder för att sekvensbestämma biosyntesapparaten och utifrån denna information härleda biosyntesförloppet. Del 2) För att på ett objektivt sätt studera alla tänkbara mekanismer i biologisk bekämpning använde vi andra molekylärbiologiska metoder, framför allt s.k. transposonmutagenes. Transposoner är främmande, och oftast artificiellt framställda DNA-bitar som kan hoppa in var som helst i arvsmassan hos bakterier, och som bär på en antibiotikaresistens som markör, så att de på detta sätt muterade cellerna enkelt kan spåras och muterade gener kan hittas och klonas. Ett antal sålunda framställda transposonmutanter testades i fröbehandlingsförsök i växthus för att notera eventuell förändrad bekämpningsaktivitet av mutanterna mot svampsjukdomen kornets bladfläcksjuka. Drygt sexhundra mutanter testades sammanlagt, och efter upprepade försök fann vi att åtta mutanter konsekvent hade nedsatt biologisk bekämpningsförmåga. Dessa åtta mutanter analyserades både på gennivå och fenotypiskt.

Slutsats och råd till näringen eller behov av vidare studier:
Del 1) De bakteriegener som kodar för en stor del av biosyntesapparaten av DDR har under projektperioden sekvenserats och kartlagts. Funktioner för individuella gener har därefter föreslagits, bl. a. med hjälp av resultat från databassökningar av liknande gener. Utländsk kemisk expertis vi samarbetat med har sedan genom denna genetiska information beskrivit en möjlig biosyntesväg för DDR. Vi har kommit fram till att biosyntesen troligast börjar med aminosyran serin, som i upprepade kemiska steg får en allt längre kolkedja efter sig. Till sist viker sig denna kolkedja tillbaks och bildar en stor ringstruktur, varpå den färdiga DDR molekylen släpps fri från biosyntesenzymerna och transporteras ut ur bakteriecellen. Bakteriemutanter som inte bildar DDR har nedsatt bekämpningsförmåga mot kornets bladfläcksjuka.
Del 2) De åtta mutanterna som hade försämrad biologisk bekämpningsaktivitet verkade ha förlorat regleringsfunktioner i cellerna, baserat på de muterade DNA-sekvensernas likhet med övriga sekvenser i databaserna. Detta bekräftades genom att studera mutanternas fenotyper. Hos tre av de åtta mutanterna hade åtskilliga fenotyper väsentligt förändrats. Förutom att den biologiska bekämpningsförmågan avsevärt hade försämrats hade de också en förändrad proteasproduktion, sideroforproduktion och svärmningsförmåga. Dessa tre är viktiga för bakteriernas överlevnad i jord, för att de skall kunna simma till växten och hjälpa växten ta upp mikronäringsämnen (sideroforer). De muterade generna stod för sensorproteiner, som känner av den miljö som bakterierna befinner sig i. När dessa proteiner får signaler från omvärlden inverkar de på huruvida och när reaktioner viktiga för till exempel biologisk bekämpning bör slås på. I samband med dessa tester noterade vi att bakterierna i stort sett genomgående koloniserar på samma ställe som svampen på fröna. Detta indikerar att det inte blir några rester av tillsatta bakterier i jorden efter sådd, eftersom de är så starkt bundna till fröet. De gick inte att detektera i jorden efter det att kornplantorna vuxit fram. Den ingående genetiska karakteriseringen av bakteriernas mekanismer har medfört att denna bakteriegrupp kommit att bli ett nytt banbrytande modellsystem inom biologisk bekämpningsforskning, även internationellt.

Forskningsresultaten är av nytta genom att de ger insikt i hur ett biologiskt bekämpningspreparat kan fungera. När man förstår hur biologisk bekämpningsförmåga regleras, t. ex. på fröet, kan man också medvetet öka effekten hos ett preparat genom att tillföra bestämda komponenter, t. ex. de signaler som sätter i gång biologisk bekämpning. Tillsats av sådana komponenter kommer troligen i framtiden att få betydelse hos företag som marknadför biologiska bekämpningsmedel och hos den enskilde lantbrukaren, för att kunna göra antagonistiska fluorescerande pseudomonader mer effektiva som sjukdomsbekämpare.