Kurering av virulensplasmider i fågelbotulismisolat för att skapa vaccinstamskandidater

Sammanfattning av slutrapport
Botulism orsakas av sporbildande, gram-positiva bakterier inom släktet Clostridium, som bär på botulinumneurotoxingenen. Bakteriestammar som orsakar fågelbotulism bär på många plasmider med potentiella virulensfaktorer. Vår hypotes är att genom att ta bort någon eller några av dessa plasmider från en stam kan vi minska virulensen och skapa en stam som ger subklinisk infektion, vilken sedan ger ett skydd mot senare exponering av fågelbotulismbakterier. En panel med modifierade isolat där enstaka eller en kombination av virulensbärande plasmider saknas har tagits fram. För att undersöka hur virulensen påverkats samt om stammarna kan ge ett skydd mot efterföljande exponering av ett fullvirulent isolat gjordes infektionsförsök på kycklingar. Resultaten visade att den infektionsmodell som sattes upp i Japan för 45 år sedan inte gick att reproducera i vårat djurhus. Ytterligare forskning om miljöfaktorer som bidrar till utveckling av botulism behövs för att avgöra vaccinstammarnas effekt.

Populärvetenskaplig sammanfattning
BAKGRUND
Botulism är en sjukdom som orsakas av ett nervgift, botulinumtoxin, som bildas av bakterien Clostridium botulinum. C. botulinum är en bakterie som främst förekommer i naturen som sporer, en mycket överlevnadskraftig livsform där bakterien inte förökar sig eller är metaboliskt aktiv. I syrefattig miljö kan sporerna bli till normala bakterier och börja föröka sig och bilda botulinumtoxin. Botulinumtoxinet är ett protein som tas upp i kroppen och som stör nervernas funktion så att förlamning uppstår. Botulism hos både människor och djur uppstår oftast genom förgiftning snarare än infektion. Botulism hos fjäderfä anses dock vara en så kallad toxikoinfektion, där djuren blir sjuka först efter att sporer av C. botulinum har blivit till bakterier i tarmen hos fåglar och bildat aktivt botulinumtoxin. Fåglar som drabbas av botulism blir allmänt ovilliga att röra sig och vill mestadels ligger ner. Om de reser sig rör de sig vingligt med okoordinerade rörelser, hänger med vingarna och har svårt att hålla huvudet upprätt. Allteftersom paralysen fortskrider får djuren svårare att andas och blir helt förlamade med hängande huvud och tillslut dör de. Svenska fjäderfäbesättningar drabbades första årtiondet på 20-hundratalet av en markant uppgång av botulismutbrott. Under åren 2003-2009 förekom ett antal omfattande utbrott av botulism och detta har gett upphov till betydande konsekvenser för de drabbade uppfödarna.
Med anledning av de många botulismutbrotten genomfördes en karaktärisering av de genetiska egenskaperna hos den sjukdomsframkallande bakterien år 2008-2010. I detta projekt framkom att bakterien utöver botulinumtoxinet även producerar andra toxiner och faktorer som kan vara viktiga för sjukdomsförloppet. De gener som ger upphov till dessa toxiner fanns framförallt lokaliserade på så kallade plasmider, separata DNA-molekyler som ofta kan förflytta sig mellan bakteriestammar. Då fåglar är relativt motståndskraftiga mot botulinumtoxinet jämfört med människor och många andra djur är vår hypotes att bakterien är beroende av att producera ytterligare toxiner för att ge en tillräckligt effektiv infektion i fåglar för att orsaka botulismutbrott. Med anledning av detta ville vi genomföra infektionsstudier där vi tagit bort bakteriens förmåga att bilda botulinumtoxin och även andra toxiner för att på så sätt skapa bakteriestammar som bara skulle kunna ge ett svagt immunsvar och därmed leda till ett skydd mot exponering av farliga botulinum-bakterier.
Två infektionsstudier på kycklingar har tidigare utförts i Japan med sporer från C. botulinum grupp III och dessa beskrevs i tidskrifter på 1970-talet. I båda fallen matades djuren med sporer där bakterien hade bibehållen förmåga att bilda botulinumtoxin och samtliga djur fick botulism inom 13 dagar.
RESULTAT
Då vi i den här studien studerade bakteriestammar som tagits fram från svenska botulismutbrott på fjäderfä fann vi mellan fyra och fem olika plasmider i varje, vilket är ovanligt många. En bakteriestam med fem plasmider valdes ut. Denna stam hade isolerats från ett utbrott 2008 i en slaktkycklingbesättning och testades positivt för sin förmåga att fortfarande bilda botulinumtoxin. Den behandlades med olika metoder så att den tappade sina plasmider. Två olika varianter av stammen valdes ut som vaccinkandidater: en som enbart tappat den plasmiden som bildar botulinumtoxin, och en som tappat ytterligare tre plasmider.
Slaktkycklingar från svenskt kläckeri anlände till SVA som daggamla kycklingar och placerades på ströbädd i två specialkonstruerade golvförsedda stålburar i SVAs djurhus. Kycklingarnas miljö efterliknade i största möjliga mån den i kommersiell uppfödning genom att de gick på ströbädd, hade fri tillgång till mat och vatten samt reglerad temperatur och ljusinsläpp. Det foder som användes valdes i samråd med produktansvarig för fågelfoder hos Lantmännen. Både start- och tillväxtfodret efterliknade kommersiellt slaktkycklingfoder i näringsinnehåll men saknade koccidiestatika. Att försöket skulle likna kommersiell uppfödning innebar också att kycklingarna skulle avlivas vid fem veckors ålder då de nått sin produktionsvikt. De fick tillsyn två gånger dagligen och vård och skötsel enligt fastställda rutiner vid SVAs djuravdelning och detta utfördes av behörig personal.
Separata grupper av veckogamla kycklingar matades med; 1. Botulinumtoxinbildande bakterier (som en kontroll för att infektionsmodellen fungerade i vår försöksdjursmiljö); 2. Två olika vaccinkandidater (bakterier utan förmågan att bilda botulinumtoxin) eller 3. Vatten (som en kontroll för att djuren mådde bra i vår försöksdjursmiljö). Varje testgrupp placerades i separata burar och varje testkategori (1-3) placerades i olika rum. Därefter observerades djuren två gånger dagligen med minst åtta timmars mellanrum för uppvisande av botulismsymptom. Planen var att avliva djuren så fort tydliga kliniska symptom eller påverkan av allmäntillståndet uppkom. Loggjournaler samt en detaljerad symptombeskrivning fanns i alla tre rummen för att kunna upptäcka tidiga sjukdomssymptom. Under infektionsförsöket samlades kycklingträck in från rummet med kycklingar som blivit matade med botulinumtoxinbildande bakterier och testades för påvisning av botulinumsporer.
Efter den första städningen av burarna kunde vi inte längre påvisa förekomst av botulinumsporer. Detta tyder på att sporerna inte hade utvecklats till bakterier och förökat sig i kycklingarna och att sporerna därmed hade försvunnit ur miljön. Sporer gavs också till tre veckors gamla fåglar, men inte heller i dessa förökade sig bakterierna. Efter 4,5 vecka hade fortfarande inga botulismsymptom uppvisats, eller andra symptom av ohälsa, och försöket avslutades enligt projektplanen. Blodprov samt blindtarmar samlades in från kycklingarna. Inget av proven innehöll vare sig botulinumtoxin eller botulinumsporer, vilket visade att bakterierna varken hade bildat toxin eller förökat sig och att infektionsmodellen därmed inte hade fungerat.
DISKUSSION
Målsättningen under infektionsförsöken var att efterlikna miljön på en slaktkycklinganläggning i mesta möjliga mån. Försöksrummen har dock höga krav på att smittämnen inte skall kunna spridas och utgör därför ofrånkomligen en onaturligt steril miljö. Äldre tiders försöksrum var troligen mindre sterila än de som används idag. I de två tidigare infektionsstudierna som finns dokumenterade där djuren blev sjuka av botulism beskrivs djurens levnadsförhållanden knapphändigt.
I vår infektionsmodell förökade sig inte bakterierna i kycklingarna och slutsatsen vi kan dra i och med det är att det krävs fler faktorer än enbart ett introducerande av botulinumsporer i slaktkycklingmiljön för att djuren ska bli sjuka. Detta i sig är en viktig och ny kunskap då man tidigare, baserat på litteraturen, kunnat utgå ifrån att kycklingar blir sjuka om botulinumsporer i tillräckligt hög grad finns närvarande i deras omgivning. Doserna av sporer vi testade var fullt tillräckliga för att orsaka botulism enligt tidigare infektionsmodeller och vi tror därför inte att djuren hade blivit sjuka om vi ökat infektionsdosen. Vi vet också med säkerhet att de bakterier som skulle orsaka botulism hade förmågan att bilda botulinumtoxin eftersom det fastställdes experimentellt i försökets början.
Då själva infektionsmodellen inte fungerade gick det inte att testa effekterna av de framtagna vaccinkandidaterna. För att kunna göra detta måste det undersökas vilka faktorer i kycklingarnas miljö som bidrar till ökad risk för botulism. Detta är ett stort åtagande och måste hamna inom ramarna för ett nytt forskningsprojekt. Möjliga faktorer som skulle kunna spela in för om sporerna växer till sig i kycklingtarmen är; pH i foder och i kycklingtarmen, bakteriesammansättning i tarmen, stress, ströbäddens och den allmänna miljöns renhet, foder- och vattenautomaternas utformning samt fodersammansättningen. Dessa riskfaktorer bör utredas ytterligare för att ta fram åtgärder mot botulismutbrott.