Nya behandlingsmetoder för att minska tillväxthämning hos grisar med spiroketal diarré

Brachyspira pilosicoli causes spirochetal diarrhea resulting in reduced growth and great economic losses in pig herds. The disease is treated with antibiotics but today we see an increased incidence of antibiotic resistance in the bacteria, which may lead to difficulties to treat the disease in the near future. How the
bacterium causes disease is unknown. We want to identify proteins of B. pilosicoli that the bacterium uses to attach to the intestinal mucosa. With knowledge of this process, we want to find ways to block the binding and thus probably prevent the onset of symptoms. The proteins may act as antigens for vaccine
development and may be used for development of new and specific diagnostic tests. We also want to develop a gut tissue model both for studying the binding of B. pilosicoli to the intestinal mucosa, and to test the effect of probiotic bacteria on the binding.

Spiroketal diarré orsakar stora ekonomiska avbräck för lantbrukaren på grund av hög smittsamhet och negativ påverkan på tillväxten. Sjukdomen orsakas av bakterien Brachyspira pilosicoli, som hör till gruppen spiroketer, och behandlas idag med antibiotika. Idag ser vi en ökad förekomst av antibiotikaresistens hos bakterien vilket gör att sjukdomen kan bli svårbehandlad i en nära framtid. Kunskaperna om hur B. pilosicoli orsakar sjukdom är ofullständiga. Vi vill identifiera proteiner hos B. pilosicoli som bakterien använder för att fästa till tarmslemhinnan. Med kunskap om den processen vill vi hitta sätt att blockera bindningen och därmed sannolikt förhindra uppkomst av symptom. Proteinerna kan fungera som antigener för vaccinutveckling och användas för utveckling av nya specifika diagnostiska tester. Vi vill även utveckla en tarmvävnadsmodell dels för att studera bindningen av B. pilosicoli till tarmslemhinna, dels för att testa effekten av probiotiska bakterier på bindningen.

Spiroketal diarré hos gris orsakas av Brachyspira pilosicoli och ger stora ekonomiska avbräck för lantbrukaren på grund av hög smittsamhet och lägre tillväxt hos grisarna. Den behandlas med antibiotika men resistensen hos bakterierna ökar. Kunskap om hur bakterien binder (adhererar) till tarmepitelceller, och hur man kan blockera bindningen, kan användas för att utveckla nya preventiva strategier som vaccin eller probiotika. I projektet har vi identifierat och undersökt potentiella adhesionsproteiner hos B. pilosicoli, dock utan att kunna påvisa specifika bindningar mellan bakterie- och värdproteiner. Vidare, utav 61 Lactobacillus-stammar som karaktäriserats och utvärderats med avseende på goda egenskaper för användning som probiotika bedömdes 8 stammar vara intressanta att studera vidare i en cellmodell, eller i framtida studier. Tekniska svårigheter med modellen medförde att laktobacillernas förmåga att motverka negativa effekter av B. pilosicoli på epitelcellerna inte kunde bedömas.

Spiroketal diarré är en tarmsjukdom hos grisar som orsakas av en bakterie tillhörande gruppen spiroketer - Brachyspira (B.) pilosicoli. Det är en i Sverige vanlig diarrésjukdom som gör att grisarna växer långsammare vilket medför stora ekonomiska förluster för producenterna. Spiroketal diarré behandlas med antibiotika men vi har i Sverige hittat multiresistenta stammar och det finns risk för att inget av de antibiotika som man får använda till gris kommer att fungera i framtiden. Hur besättningar smittas och hur bakterien orsakar sjukdom är till stora delar okänt. Bakterien binder till tarmepitelet på ett speciellt sätt- ena änden av bakterien fäster till cellerna i tarmen och tillsammans liknar de en ryamatta. Mekanismen för detta är okänd. Syftet med det här projektet var att öka kunskapen om hur bakterien fäster till tarmen för att i ett senare skede kunna använda kunskapen till att utveckla nya förebyggande behandlingar, som vaccin eller probiotika.

För att ta reda på vilka proteiner hos B. pilosicoli som gör att bakterien fäster till tarmen användes tekniken fagdisplay. Då används ett så kallat fagbibliotek där en bakteries samtliga proteiner finns representerade. Med biblioteket ”fiskas” just de proteiner man är intresserad av ut i en process kallad panning. Vi har pannat ett fagbibliotek med B. pilosicoli-proteiner mot tarmepitelceller för att hitta de som binder dit. Vi har också pannat mot annat material från gris, som tarmvävnad och rena vävnadskomponenter, för att försöka hitta proteiner som är viktiga för bakterien för att kunna infektera. Problem med bakgrund gjorde det svårt att hitta äkta bindningar mellan bakterien och komponenter från gris. Vi försökte komma runt det genom att utveckla en ny metod för att analysera resultatet men fick trots det inte fram några lovande resultat för att förklara bindningen av B. pilosicoli till tarmepitelceller.

Ett annat försök att angripa problemet på, genom bioinformatik, gjordes. Många dataprogram finns tillgängliga på internet för att analysera de DNA-sekvenser av organismers arvsmassa som också finns tillgängliga där, även den för B. pilosicoli. Arvsmassan innehåller information om bakteriens alla proteiner och dataprogrammen användes för att leta efter proteiner som sitter på ytan av B. pilosicoli och som ansågs ha stor potential att interagera med andra molekyler. Fyra proteinkandidater valdes ut och framställdes på konstgjord väg med hjälp av kloning. Proteinerna undersöktes i olika experiment om de kunde binda specifikt till någon komponent från gris men ingen specifik bindning mellan proteinerna och griskomponenterna kunde påvisas.

I projektet ingick också att undersöka ett 60-tal bakteriestammar av släktet Lactobacillus (LAB) för att ta fram ett mindre antal stammar som skulle vara lämpliga att använda som probiotika. Dessa stammar skulle sedan testas i en cellodlingsmodell för att se om de kan motverka negativa effekter av B. pilosicoli på tarmepitelcellerna. Av alla LAB-stammar som undersöktes visade sig 8 stycken ha viktiga egenskaper för att kunna användas som probiotiska bakterier – ingen överförbar antibiotikaresistens, tålighet mot sur miljö och miljö med galla (för att överleva passage genom mag-tarmkanalen) samt bindning till tarmcellernas sekret (mucus). En cellodlingsmodell med tarmepitelceller sattes upp för att studera dessa LAB-stammar tillsammans med B. pilosicoli-bakterier men tekniska problem med modellen gjorde att det var svårt att tolka resultaten.

Det är fortsatt viktigt att öka kunskapen om hur B. pilosicoli fäster till tarmen och att undersöka om LAB-stammar kan motverka negativa effekter av B. pilosicoli på tarmepitelet. Däremot måste andra metoder prövas och vi tror att ytterligare bioinformatiska analyser och andra cell- eller vävnadsmodeller kan vara sätt att komma framåt. LAB-stammarna med egenskaper viktiga för att kunna användas som probiotiska bakterier kan vara av generellt intresse att använda i framtida projekt om probiotika till gris.