Nya metoder för utvärdering och optimering av fertilitet hos avelshingstar

Sammanfattning av slutrapport
Hypotesen att en förbättring av kvaliteten hos spermiedoser för artificiell insemination (AI) med Single Layer Centrifugation (SLC) genom Androcoll-E leder till en ökad dräktighetskvot testades hos ston inseminerade 24 timmar efter att spermieprovet insamlats. SLC-proverna resulterade i en signifikant högre dräktighetsprocent (73%) jämfört med oselekterade kontrollprover (46%). Dessutom behöll de SLC-selekterade proverna befruktningsförmågan i 96 timmar (dräktighetsprocent 75%) medan oselekterade prover vanligtvis har en hållbarhet på 24-36 timmar. SLC har tidigare visats förbättra fruktsamheten hos problemejakulat, nu kan också kvaliteten hos normala ejakulat förbättras med denna teknik. Utbytet av spermier som erhölls efter SLC visade en hög korrelation med dräktighetskvoten hos det oselekterade ejakulatet. Eftersom det är möjligt att utföra SLC vid stuteriet, så kan SLC användas som en indikator på hingstens potentiella fertilitet istället för att genomföra ett tidsödande AI-försök.

Populärvetenskaplig sammanfattning
I december 2010 beviljade SSH finansiering under två år för ett projekt från forskare vid Sveriges Lantbruksuniversitet (SLU) och Flyinge AB. Syften för projektet var att pröva om den förbättrade spermiekvaliteten som erhålls genom Single Layer Centrifugation (SLC) genom en artspecifik kolloid avspeglas i öka andel dräktiga ston efter artificiell inseminering (AI), och att bestämma om utbytet efter SLC eller en metod för bindning till zona pellucida kan användas som en indikator för potentiell fertilitet efter AI.

Hästuppfödningsbranschen i Sverige är intresserad av att förbättra kvaliteten hos spermiedoser för AI, både för att öka andel dräktiga ston efter AI vid stuterier inom landet, och för att förbättra ryktet och konkurrenskraften hos den svenska näringen i ett globalt perspektiv. SLC-metoden har visat sig förbättra spermiekvaliteten i laboratoriet, både omedelbart efter preparation, och när proverna lagrats i upp till 96 timmar. I detta projekt var fertiliteten hos SLC-selekterade spermier med ”normal” fertilitet (dvs hingstarna hade inga kända fertilitetsproblem), som användes för insemination efter 24 timmars kylförvaring, bättre än hos oselekterade kontrollprover (73% för SLC, 46% för kontroller; P<0.001). Det har tidigare visats att SLC förbättrade fertiliteten i hingstar med fertilitetsproblem. Nu har vi, för första gången, visat att SLC kan förbättra fertiliteten också i hingstar som inte har sådana problem. Dessutom var befruktningsförmågan hos dessa SLC-selekterade prover god ännu efter 96 timmars kylförvaring (75%). Normalt lagras hingstsperma endast 24-36 timmar, därför är det ett viktigt genombrott när det gäller kylförvaring att kunna erhålla höga dräktighetsprocent efter 96 timmars lagring av proverna. Sådana långa förvaringstider kan underlätta när det gäller möjligheten att skicka spermaprover till andra länder, eller under helger, när postgången inte är tillgänglig. SLC-metoden har visat sig vara praktisk och effektiv att använda för personal vid stuterier, och den producerar tillräckligt med spermier för konventionell AI.

En ny tillämpning för SLC utvecklades, med användning av lagrad hingstsperma. SLC som utfördes 24 timmar efter insamling av spermieprovet var effektiv när det gäller att selektera fram spermier av god kvalitet, och när det gäller att förlänga tiden som provet var användbart, och därmed förlängdes hållbarheten så att prover som inte kan användas när de anländer till stuteriet kan användas vid ett senare tillfälle. Detta gör det även möjligt för stuteriet att sända prover till ett laboratorium för utvärdering av spermiekvalitet, och potentiellt för at förutsäga fertilitet (se nedan).

Vissa forskare har uttryckt farhågor gällande att all seminal plasma (SP) tas bor från proven vid SLC. Deras argument är ett SP behövs för att säkerställa livmoderns förmåga till rensning efter AI. Ett experiment utfördes för att undersöka effekten av att sätta tillbaka SP till SLC-selekterade prover. I låga koncentrationer (5-10%) gav tillsats av SP en tillfällig ökning av spermiernas motilitet. Dock visade det sig att om proverna med tillsatt SP lagrades i 24 timmar, så förlorades denna förbättring av motilitet, och skadorna på spermiernas kromatin ökade. Därför skall SP inte tillsättas till SLC-selekterade prover innan lagring, men det kan tillsättas omedelbart före insemination, om man vill erhålla dess positiva effekt på motilitet och livmoderns rensning.

En preliminär studie utfördes med prostasomer som isolerats från hingstsperma av kollegor från Akademiska Sjukhuset, Uppsala. Tillsats av prostasomer till SLC-selekterade spermieprover gav en liknande ökning av spermiemotiliteten som hade observerats efter tillsats av 5-10% SP, vilket antyder att det är prostasomer som är källan till de positiva effekterna på spermiemotiliteten. Fortsatta försök är nödvändiga för att utreda dessa resultats betydelse och biologiska relevans.

Att identifiera en indikator för en hingsts potentiella fertilitet är också av stort intresse för hästuppfödningsnäringen. I nuläget är användning av sperma för AI det enda sättet att bestämma en hingsts fertilitet, vilket är tidsödande och kostsamt. Ett AI-försök måste utföras med tillräckligt många ston för att kunna utesluta faktorer som stonas förmåga att bli dräktiga, variationer i AI-teknik och tidpunkt för AI relativt ägglossning, som annars kan påverka resultaten. Det finns också en miljömässig nackdel med att transportera runt spermiedoser över landet, bara för att upptäcka att spermiedoser inte leder till dräktigheter efter AI. Därför skulle en pålitlig indikator på potentiell fertilitet kunna bidra till att minska miljöpåverka från hästuppfödningsnäringen. Det fanns ett signifikant samband mellan utbytet av spermier efter SLC och dräktighetskvoten för det oselekterade ejakulatet, vilket indikerar att SLC kan användas som ett diagnostiskt redskap för att förutsäga fertiliteten hos en viss hingst eller ett visst ejakulat utan att genomföra ett AI-försök. Resultaten visade sig vara lika bra på att förutsäga fertilitet som spermieviabilitet och kromatinintegritet, uppmätt med flödescytometri. SLC-metoden är snabb (den tar ca 30 minuter, vilket inkluderar 20 minuters centrifugering) och kan användas vid stuteriet, medan andra potentiella diagnostiska metoder kräver antingen dyr utrustning (som t.ex. en flödescytometer), eller att ett prov sänds till ett laboratorium för morfologisk utvärdering, vilket är tidsödande och dyrt. En zona-bindningsmetod, där förmågan hos hingstspermier att binda till zona pellucida hos äggceller från en annan art, har nackdelen att den kräver speciell utrustning och upplärning av personal, samt tillgång till slakterimaterial som källa för bovina eller ovina äggceller. Dessutom är protokollet för kapacitering av hingstspermier inte optimerat, därför är zona-bindningsmetoden inte av praktisk användbarhet för att förutsäga fertilitet vid de flesta stuterier för närvarande.

I ett samarbete med forskare vid Gluck Equine Research Center, Lexington, Kentucky, visade det sig att SLC-metoden kunde separera spermier från ekvint artritvirus (EVA) och bakterier i sädesvätskan. Dock kvarstod låga nivåer av bakterier och virus i proverna, och det är inte känt om dessa nivåer är tillräckligt höga för att orsaka problem i inseminerade ston. Därför behövs fortsatt forskning för att fastställa om SLC kan användas för att förbättra biosäkerheten hos hingstspermieprover, t.ex. för att undvika användning av antibiotika när det gäller bakterier.

Projektet har avsatt ett stort antal referee-granskade artiklar (10 originalartiklar och två review-artiklar) och konferenspresentationer (10). Ett antal besök vid stuterier har gjorts, och information har presenterats för hästuppfödare vid Avelschampionatet i Flyinge 2011. Studiens viktigaste resultat är att SLC enkelt kan användas vid stuterier för att förbättra hingstar fertilitet, även för hingstar utan kända fertilitetsproblem. Dessutom kan SLC användas som en indikator på potentiell fertilitet istället för ett utdraget AI-försök. Möjligheten att ta bort bakterier och virus ur spermieproverna är värt vidare undersökningar.