Peptider och proteiner – bekämpning av nya missbrukspreparat inom hästsporten

The abuse of peptide- and protein-based substances has emerged as a new problem in horse racing. Examples are cobratoxin and dermorphin for pain relief, erythropoietin (EPO) for enhanced oxygen transport, and growth stimulating peptides of different kind. The use of this type of substances creates a great animal welfare problem, as there are generally no safety studies in horses which means that the possible side effects are unknown. Peptides and proteins often demand special treatment when it comes to chemical analysis and they cannot generally be incorporated into the regular screening procedures. The extent of the abuse of peptide- and protein-based drugs in the Nordic countries is unknown. The presented project aims at development, implementation and validation of mass spectrometric analytical methods for peptides and proteins (year 1) and a subsequent field study where race horses in Norway and Sweden will be tested and the samples will be analyzed by the methods developed.

Missbruk av peptid- och proteinbaserade preparat har framkommit som ett nytt problem inom hästsporten. Några exempel är kobratoxin och dermorfin för smärtlindring, erytropoetin (EPO) för att förbättra syretransporten, samt tillväxtstimulerande peptider av olika slag. Bruket av denna typ av preparat innebär ett stort djurskyddsproblem, eftersom säkerhetsstudier på häst oftast saknas och kunskapen om biverkningar är minimal. Peptider och proteiner kräver ofta speciell hantering när det gäller kemisk analys och de kan i allmänhet inte inkorporeras i de reguljära dopningskontrollmetoderna. Omfattningen av bruket av denna typ av preparat i de nordiska länderna är till stor del okänd. Föreliggande projekt syftar till att dels utvecka, validera och implementera nya analytiska metoder baserade på masspektrometri för att analysera peptider och proteiner (år 1), dels att utföra en fältstudie i Norge och Sverige där tävlingshästar provtages och proverna analyseras med de utevcklade metoderna.

Det kommer ständigt information om nya preparat som kan missbrukas i samband med tävling. På senare år har en helt ny typ av substanser uppmärksammats - peptider och proteiner. Dessa ämnen skiljer sig i storlek och utseende från de klassiska missbrukspreparaten och har därför tidigare inte täckts in i dopningskontrollen. Vi har utvecklat och validerat analysmetoder för denna typ av substanser samt använt metoderna för att undersöka missbruk av peptider och proteiner inom den skandinaviska travsporten. I vårt arbete har vi funnit att stabiliteten av dessa preparat kan variera stort. Därför bör provtagning för analys av peptider och proteiner planeras noggrant. Eftersom det också finns stora skillnader i hur och när substanserna används måste provtagningstillfället anpassas efter vilken typ av peptider eller proteiner man vill undersöka. Vi har markant stärkt vår analysförmåga för att övervaka missbruk och står idag, tack vare det här projektet, mycket starkare än tidigare.

Gammalt problem i ny form
Det florerar alltid rykten om nya sätt att dopa hästar och laboratorierna måste kontinuerligt anpassa sina metoder till förändringar i omvärlden. År 2007 gjordes ett intressant fynd som öppnade upp ögonen för en ny klass av dopningssubstanser. Fyndet bestod i att man hittat ampuller med kobratoxin – ett ämne med smärtlindrande egenskaper – i ett stall i USA. Kobratoxin är ett protein, alltså en kedja av aminosyror, som i både utseende och storlek skiljer sig stort från klassiska läkemedel och andra missbrukssubstanser. Det som gjorde det hela extra oroväckande var att denna typ av ämnen inte kunde upptäckas i de dopningsanalyser som då användes. Därefter följde ytterligare fynd av ett liknande preparat, dermorfin, som också har smärtlindrande egenskaper. Dermorfin är en så kallad peptid som består av en kortare aminosyrakedja än vad proteiner har. Användning av otillåtna peptider har inte heller kunnat upptäckas med konventionella dopningskontrollmetoder. Alla proteiner och peptider verkar inte på samma sätt. Precis som med andra dopningsmedel så kan vissa ha t.ex. en smärtstillande effekt medan andra kan bidra till att bygga upp muskler.

Förutom att behandling med otillåtna substanser påverkar ett rättvist tävlingsutövande så har även djurskyddsmotivet varit väldigt viktigt för detta projekt. De flesta peptider och proteiner har aldrig testats på häst och ingen vet på vilket sätt djuret påverkas. Det betyder att bruk av denna typ av ämnen innebär ett avsevärt djurskyddsproblem. Det är alltså väldigt viktigt att kontrollaboratorierna har effektiva analysmetoder för att kunna upptäcka otillåten användning av peptider och proteiner.

Mål med projektet
Målet med detta projekt har varit att stärka förmågan inom den skandinaviska dopningskontrollen genom att utveckla nya analysmetoder för peptider och proteiner. Metoderna har också validerats, d.v.s. funktionstestats enligt förutbestämda rutiner för att visa att deras prestanda är tillräckligt bra. En viktig sak att studera under valideringen är om de peptider och proteiner som metoderna är riktade mot är stabila i proverna under transport och förvaring. Ett ytterligare mål med projektet var även att använda de utvecklade metoderna till att analysera ett större antal prover från svenska och norska tävlingshästar.

Nya svårigheter
Att leta efter proteiner och peptider i dopningsprover är förknippat med en del svårigheter som normalt inte är ett problem i dopningsanalyser. Framför allt så bryter kroppen ner peptider och proteiner mycket snabbt. Dessutom finns det risk att de bryts ner i proverna under transport och förvaring. Att komma underfund med och försöka tackla dessa svårigheter har också varit en del i projektet.

Nya lösningar
Detta projekt som utförts med finansiering av Stiftelsen hästforskning har bidragit till att arsenalen av analysmetoder inom den skandinaviska dopningskontrollen signifikant har förbättrats. Vi har tagit fram flera analysmetoder baserade på s.k. vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS/MS) för peptider och proteiner, som nu kan tillämpas i den rutinmässiga dopningskontrollen. Vi står således idag mycket starkare rustade än för några år sedan vad gäller att möta morgondagens missbrukssubstanser. Alla peptider som vi har undersökt är mycket mer stabila i urin än vad de är i blod. Därför anser vi att man i första hand ska ta urinprover vid kontroll av peptider. Det är också värt att överväga provtagningstillfälle beroende på vad man söker efter, d.v.s. att ta fler träningsprover i sökande efter uppbyggande peptider, medan tävlingsprover är bäst för att söka efter smärtlindrande ämnen.