Utvärdering av Clostridium perfringens typ A och Clostridium difficiles koppling till spädgrisdiarré

During the last decade, neonatal porcine diarrhoea (NPD) has become an increased problem in Swedish herds. Clostridium (C.) perfringens type A (CpA) and C. difficile (Cd) have been highlighted as causes of NPD but their importance has also been questioned. We have previously demonstrated that CpA and Cd can be found in both diarrhoeic and healthy piglets. However, since pathogenic strains of CpA and Cd cannot be differentiated from strains found in healthy pigs and the diagnostic value of toxin-detection in stool is uncertain we have neither been able to confirm or rule them out as the cause of disease. To fill these knowledge gaps, we now want to proceed with comprehensive comparisons of CpA strains isolated from diarrhoeic and healthy piglets and evaluate if Cd-toxin can be detected in faeces from healthy piglets. This will either weaken or strengthen the association between these bacteria and NPD and generate information that can be used for the development of reliable diagnostics.

Under det senaste decenniet har spädgrisdiarré blivit ett vanligt problem i Svenska besättningar. Clostridium (C.) perfringens typ A (CpA) och C. difficile (Cd) har pekats ut som orsaker till spädgrisdiarré men deras betydelse är omtvisad. Vi har tidigare påvisat CpA och Cd hos både sjuka och friska grisar men vare sig kunnat fastställa eller utesluta dem som orsak till sjukdom. I nuläget kan man nämligen inte skilja på sjukdomsorsakande stammar av dessa bakterier och de stammar som man normalt hittar i tarmen. Man vet inte heller vad påvisande av dessa bakteriers toxiner i träck har för betydelse. För att fylla dessa kunskapsluckor vill vi nu gå vidare med omfattande jämförelser mellan stammar av CpA isolerade från sjuka och friska grisar samt även utvärdera om Cd-toxin kan påvisas i träck från friska grisar. Detta kommer antingen att tala för eller emot att dessa bakterier orsakar spädgrisdiarré samt generera information som kan användas för utveckling av tillförlitlig diagnostik.

Under det senaste decenniet har spädgrisdiarré blivit allt vanligare både i Sverige och andra länder. I en tidigare studie har vi visat att från tio gårdar med diarré-problem, var, i hälften av besättningarna, Enterococcus hirae den troligen orsaken. På alla gårdar hittades Clostridium perfringens typ A (CpA) och C. difficile (CD). Dessa två bakterie-arter hittas ofta vid spädgrisdiarré, men även hos friska spädgrisar. Vi ville därför undersöka om vi kunde finna genetiska skillnader mellan isolat av CpA från friska respektive sjuka djur. Analyser av över 200 isolat av CpA kunde inte särskilja grupperna. Det är därför inte troligt att CpA är en orsak till ökningen av spädgrisdiarrér. Snabbtester för påvisande av Cd-toxin har använts för att diagnostisera CD som sjukdomsorsak. Vi undersökte därför om Cd-toxin kunde påvisas i träck från friska gspädrisar. Eftersom så var fallet kan vi inte rekommendera denna typ av snabbtester för att fastställa orsaken till spädgrisdiarrér.

Bakgrund
Vår forskning om anledningen till ökningen av spädgrisdiarré (NPD) i Sverige indikerar att det kan finnas mer än en orsak. En tidigare studie av tio drabbade grisbesättningar visade att Enterococcus hirae var den troliga orsaken till sjukdom på ca hälften av gårdarna. I alla besättningar var bakterier som vanligen förknippas med spädgrissjukdom antingen frånvarande, Clostridium perfringens typ C, eller sällsynta, ETEC. Dock hittades C. perfringens (Cp) typ A och C. difficile (CD) i alla besättningar. Dessa bakterier betraktas ofta som sjukdomsorsakande. Även om få studier har utförts på friska spädgrisar verkar C. perfringens typ A och C. difficile förekomma lika vanligt på gårdar som inte rapporterat NPD som drabbade gårdar.

Syfte, mål, metoder och resultat
För att grundligare utreda Cp & CD:s roll vid spädgrisdiareér, har prover och bakterieisolat från fem friska besättningar och fem besättningar med problem med NPD jämförts med olika diagnosiska och molekylära tmetoder.

Projektet hade tre huvudmål och slutsatsen för vart och ett av dessa mål presenteras nedan:

Mål: 1 & 2: Undersöka diversiteten hos CpA-isolat från friska spädgrisar och smågrisar med diarré, samt karaktärisera ev. genetiska skillnader i CpA-stammar isolerade från friska respektive sjuka djur.

Den genetiska diversiteten hos CpA-isolat visade sig vara låg, grundat på typning med cpn60 gen sekvensering och 6-loci MLVA. Baserat på dessa två metoder samt helgenomsekvensering följt av nukleoidpolymorfism-analys av en utvald grupp isolat, kunde inga genetiska skillnader mellan friska och diarrégrisar påvisas. Resultaten talar för att CpA som orsak till NPD i dessa besättningar är osannolikt. Det är dock fortfarande möjligt att även om isolaten är mycket lika genetiskt, kan de ha förvärvat olika virulensgener. Innan vi publicerar våra resultat kommer vi därför att göra en djupare undersökning av helgenom-data för olika virulens- och adhesionsfaktorer, som kan skilja sig även inom genetiska subtyper.

Mål 3. Undersök om Cd-toxin kan detekteras i feces från friska nyfödda grisar

Närvaron av CD i avföring hos friska spädgrisar kunde bekräftas med ett antigen test, och produktion av toxiner kunde påvisas i några av avföringsproven med samma metod. Eftersom Cd-toxiner kan upptäckas i feces från friska spädgrisar från gårdar med friska djur, kan tester som CDqc inte användas för att diagnostisera CD som orsak till diarréer. kunde CD kunde isoleras från en majoritet av friska djur. Med samma antigentest som användes för avföringsproven, kunde alla, utom ett, isolat producera CD-toxiner in vitro. Alla isolat visade sig också bära på Cd-toxegener med qPCR.

Nytta för näringen & rekommendationer:

Vår forskning om orsakerna till ökningen av diarré hos spädgrisar indikerar att det kan finnas mer än en orsak.

För att utveckla riktlinjer för antimikrobiell behandling, specifika och känsliga diagnostiska metoder och effektiva förebyggande åtgärder, måste det orsakande patogenen vara känt. Detta projekt syftade således till att belysa Cp och CD: s roll i NPD i Sverige. Våra resultat visar att Cp och CD är osannolika orsaker till diarré hos spädgrisar. Båda bakterie-arterna var lika vanligt förekommande hos friska som sjuka djur. För Cp fann vi en låg genetisk diversitet mellan isolat och inga uppenbara genetiska skillnader mellan isolat från dessa två grupper av djur. Därför är vaccination och / eller antibiotikabehandling mot Clostiridier (främst CpA) troligen onödigt.

Båda bakterie-arterna har emellertid förmåga att bära olika virulensegenskaper oavsett genetisk subtyp. De nya genomiska verktygen som nu finns tillgängliga, såsom helgenomsekvensering, öppnar möjligheterna att ytterligare karakterisera vår isolatsamling.

Det kan noteras att genom helgenomsekvensering kunde vi visa att varje gård hade olika CD-varianter, varianter som tidigare har associerats med sjukdom hos människa. Denna kunskap är viktig för att förhindra CD-infektion hos djurägare eller deras personal.